联系我们 / CONTACT US

侧栏联系我们
公司名称:必威娱乐平台|betway必威娱乐城|betway88客户端
地址:西安市太白小区南区11号楼1单
元2楼西户
Email: xfyangbio@163.com
电话:029-88237772
传真:029-88237772

在线留言 / ONLINE MESSAGE

RT-PCR 相关betway必威娱乐城

RNAfast1000总RNA提取betway必威娱乐城盒

发布日期:2015-02-13阅读次数:1782

RNAfast1000RNA提取betway必威娱乐城盒

货号: RN03    规格:50T       适用范围:  适用于快速提取各种全血、骨髓、组织、细胞、体液等样品

v betway必威娱乐城盒组成、储存、稳定性:

betway必威娱乐城盒组成

保存

 

50

平衡液

室温

 

5ml

裂解液RL

4℃避光

 

50 ml

氯仿

室温避光

 

12ml

聚合液RB2

室温

 

30ml

漂洗液RW

室温

            15 ml
第一次使用前按说明加指定量45ml乙醇

RNase-free H2O

室温

 

10 ml

RNase-free吸附柱RA

 

 

50

收集管(2ml

室温

 

50

 

保存条件:室温,保质期2年。裂解液RL4℃避光保存保质期更长。

v 储存事项:

1. 所有的溶液应该是澄清的,如果环境温度低时溶液可能形成沉淀,此时不应该直接使用,可37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清。

2. 不合适的储存于低温(4℃或者-20℃)会造成溶液沉淀,影响使用效果,因此运输和储存均在室温下(15℃25℃)进行。裂解液RL可以常温运输,收到后4℃避光保存

3. 避免betway必威娱乐城长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。

v 产品介绍:

改进的裂解液RL一步法裂解细胞和灭活RNA 酶, 然后总RNA在高离盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜, 再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤将细胞代谢物、蛋白等杂质去除, 最后低盐的RNase free water将纯净的RNA从硅基质膜上洗脱。

v 产品特点:

1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。克服了国产betway必威娱乐城盒膜质量不稳定的弊端。

2. 纯度高和离心柱方便快捷,不需要异丙醇沉淀和乙醇洗涤过程,RNA可以直接从离心柱上洗脱避免了过度干燥不易溶解问题。

3. 独有的RL裂解液配方,可以有效的消除基因组污染多次漂洗去蛋白过程,提取RNA纯度更高。

4. 有效的去除了5S在总RNA中含量,提高了纯度。

v 注意事项

第一次使用前请先在漂洗液RW瓶中加入指定量乙醇,加入后请及时打  钩标记已加入乙醇,以免多次加入!

为防止RNA降解,所有离心步骤如未加说明,均在4℃低温进行。离心均以相对离心力g为单位,使用转速可以达到13500 g 的台式离心机,如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

裂解液RL和去蛋白液RE中含有刺激性有害化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗

避免环境中RNA酶污染,操作要戴手套,所有吸头和 eppendorf 管以进口无菌无酶的最好。

血液抽取后应在4小时内提取RNA。冻存的血液RNA大部分丢失,不能用于提取。

本betway必威娱乐城盒含有实验室常用betway必威娱乐城氯仿,用户使用无需要自备氯仿。

尽量保证在膜中央加入洗脱液25μl-50μl,低于25μl将不能保证充分浸润吸附膜。

洗脱液pH<7.0时会降低RNA的洗脱效率,而国内实验室用水大多呈偏酸性,自备洗脱液时应当注意。本betway必威娱乐城盒提供的洗脱液为pH7.6

加入裂解液RL匀浆后,加氯仿前,样品可在 –60-70℃ 保存一个月以上。

v 操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)

ð 提示:第一次使用前请先在漂洗液RW瓶中加入指定量乙醇

1. 关于平衡液的使用

   核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会老化而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团,提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液,若不小心碰到,请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖,以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成,请加热至37℃使沉淀完全消失。

   使用方法:吸取100μl的平衡液至柱子中。13000 rpm离心1分钟,倒掉收集管中废液,将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。

2.样本预处理a抗凝全血、骨髓:取1-2ml放入离心管中,12,000rpm离心2min,吸取中间白膜层细胞100μl1.5ml eppendorf管中(吸取时用普通加样枪头口太小,剪去约5mm尖即可)。然后加入1ml裂解液RL进行充分的裂解,吸取的白膜层细胞中混有大量红细胞,不影响后继提取;b组织块50~100mg组织加1ml的裂解液RL后用筛网(本公司有售)或玻璃匀浆器搅匀组织样品进行裂解,对于坚硬的组织(骨)需于液氮内用研钵磨碎,再匀浆。组织样品体积不能超过RL容积的10%c培养细胞:贴壁细胞直接往直径3.5 cm的培养板中加入1mlRL溶解细胞,并用移液枪轻轻吹打混匀。依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的RL量(每10cm21ml)。一般情况下,普通大小的细胞培养瓶,加入1mlRL, 迅速轻摇使RL充分和瓶底所有细胞接触裂解细胞并灭活RNA酶,轻轻用移液枪反复吹打混匀。当RL量不足时可导致抽提的RNA中污染有DNA悬浮细胞:通过离心来沉淀细胞。在RLbetway必威娱乐城中用移液枪反复吹打来裂解细胞。每5~10×106的动物细胞,植物或酵母菌细胞或每1×107细菌加1mlRL进行裂解。在加入RL前应避免洗涤细胞,否则会增加mRNA降解的可能性。破裂某些酵母菌和细菌可能需要使用匀浆器。d. 体液及其它液体样本:尿液、腹水、胸水、脑积液等根据需要取1-10ml3,000rpm离心2min,留下沉淀及约100μl上清,充分震荡悬浮沉淀,取100μl放入eppendorf管中,然后加入1ml裂解液RL进行充分的裂解。

3.处理好的样本中,室温裂解5min

4.加入氯仿200μl,充分颠倒混匀1min,成均一的乳糜状,静置1分钟,12000g离心5min

5.将上清液小心转移到RNase-free 1.5ml eppendorf(离心分层后可以吸取上层无色液体约为400µl,注意不要吸取任何中间层物质)

6.加入等体积的聚合液RB2400μl,充分颠倒混匀1min

7.将混匀后的液体吸入或直接倒入内套管,13500g离心1min废液,将吸附柱重新套回收集管

8内套管中加入500 μl洗液RW13500g离心1min再重复此过程洗一次。

9.取出内套管,弃去外套管中液体,仍然套回内套管,不加洗液,13500g离心1min

10.将内套管移入新的eppendorf 管中,在膜中央加入洗脱液RNase-free H2OpH>7.0DEPC处理水)30μl4静置5min13500g离心1min,获得总RNA

v 问题与解决方法

问题

评论与建议

问题

 

RNA产量低

*样品裂解或者匀浆不彻底-建议:液氮研磨的时候尽量研磨完全或者使用组织研磨筛网进行单细胞分离后裂解;*使用的样品或者裂解物在-20℃或者-70℃存放太久-建议:应尽快的处理样品或者裂解物*组织本身含RNA-建议:对于含量少的组织应该适当提高起始处理量。

*超过了吸附柱的最大吸附能力-建议:同一个样品使用多个吸附柱,然后合并得到RNA

*漂洗液RW内忘记加乙醇-建议:第一次实验时,漂洗液RW瓶中加入指定量无水乙醇。

OD260/OD280
吸光度比值<1.6

*分光光度计检测吸光度时,RNA样品不是溶于TE,而是溶于水。低离子浓度和低pH条件下,OD280值会较高,造成比值低。-建议:检测时用TE稀释样品

*污染了蛋白或者苯酚-建议:做步骤5吸取上清水相的时候小心不要吸取到中间相和下层有机相,确保做了步骤8

下游的RT-PCR
实验不成功

*忘记做步骤11,或者将吸附柱取出时下端碰到了收集管里面的漂洗液,造成洗脱下来的RNA含有乙醇,乙醇抑制了逆转录反应-建议:确保做了步骤11,然后小心取出吸附柱,可以在空气中晾几分钟,让残留乙醇挥发。

Origin:  Aidlab Biotechnology,  Inc of China

Distributor: Pioneer Biotechnolgy,Inc 

Contact:  Tel 029-88237772 or 13484545009  Fax 029-88237772

  E-mail : xfyangbio@163.com           Internet: www.xfbio.com