联系我们 / CONTACT US

侧栏联系我们
公司名称:必威娱乐平台|betway必威娱乐城|betway88客户端
地址:西安市太白小区南区11号楼1单
元2楼西户
Email: xfyangbio@163.com
电话:029-88237772
传真:029-88237772

在线留言 / ONLINE MESSAGE

常见技术问题

PCR扩增产物的检测分析

发布日期:2014-12-27阅读次数:2797
PCR扩增反应完成之后,必须通过严格的鉴定,才能确定是否真正得到了准确可靠的预期特定扩增产物。凝胶电泳是检测PCR产物常用和最简便的方法,能判断产物的大小,有助于产物的鉴定。凝胶电泳常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳,前者主要用于DNA片段大于100bp者,后者主要用来检测小片段DNA。
1.琼脂糖凝胶电泳
这是实验室最常用的方法,简便易行,只需少量DNA即可进行实验。其原理是不同大小的DNA分子通过琼脂糖凝胶时,由于泳动速度不同而被分离,经溴化乙锭(EB)染色,在紫外光照射下DNA分子发出荧光而判定其分子的大小。
用于电泳检测PCR产物的琼脂糖浓度常为1%—2%,应该使用纯度高的电泳纯级琼脂糖,这种琼脂糖已除去了荧光抑制剂及核酸酶等杂质。
    (1)制胶
琼脂糖凝胶厚度约为3~5mm。过薄则加样孔样品会溢出来,过厚观察时荧光穿透不强以至有些小片段DNA带型不易分辨。如配制2%凝胶100ml,称取琼脂糖2g于三角瓶中,加入100ml 0.5×TBE液,微波炉加热2-5min,使琼脂糖完全溶解(注意不要暴沸),置室温等温度下降至60℃时,加入终浓度0.5μg/ml的EB液,充分混匀后倒板(注意排除气体)。
(2)加样和电泳
上样时一般取PCR反应液5~10μl,加入3μl溴酚兰液,充分混匀,加入凝胶加样孔中。电泳仪可用一般稳压可调中压电泳仪,电泳工作液为0.5×TBE液,接通电源,使样品由负极向正极移动。60-100V恒压电泳约30-60分钟。
(3)检测
将凝胶板放在紫外透射仪的石英玻璃台上进行检测,DNA产物与荧光染料EB形成橙黄色荧光复合物。观察各泳道是否有橙黄色荧光带出现,并与扩增时所设的阳性对照比较,判断阳性或阴性结果。也可在电泳时以标准分子量作对照,判断其扩增片段是否与设计的大小相一致。
2、聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳繁琐,但在引物纯化、PCR扩增指纹图、多重PCR扩增、PCR扩增产物的酶切限制性长度多态性分析时常用到。
它与琼脂糖凝胶电泳比较具有如下优点:①分辨率很强,可达1bp;②能装载的DNA量大,达每孔10μgDNA;③回收的DNA纯度高;④其银染法的灵敏度较琼脂糖中EB染色法高2~5倍;⑤避免了EB迅速退色的弱点,银染的凝胶干燥后可长期保存。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨DNA片段的有效范围:

聚丙烯酰浓度(%
有效分离范围(bp
溴酚兰位置(bp
二甲苯青FF位置(bp
20
6~100
12
45
15
25~150
15
60
12
40~200
20
70
8
60~400
45
160
5
80~500
65
260
3.5
100~1000
100
460

(1)制胶
在两块制胶玻璃板中间放上垫片,放上制胶架,拧紧制胶螺丝夹紧玻璃板。
制备适量合适浓度的凝胶,使之略多于胶板。制备100μl体积凝胶的配制方法见下表。
 
不同浓度(%)聚丙酰胺凝胶的制法:

betway必威娱乐城
3.5%
5%
8%
12%
20%
30%丙烯酰胺溶液(ml
11.6
16.6
26.6
40
66.6
水(ml
67.7
62.7
26.6
40
66.6
5×TBEml
20
20
20
20
20
10%过硫酸铵(ml
0.7
0.7
0.7
0.7
0.7
TEMEDml
0.035
0.035
0.035
0.035
0.035

在加入TEMED和10%过硫酸铵后,立即混匀,倒入放置45℃角的玻璃板内,完全注满(注意不要有气泡),迅速将玻璃板放置水平位置。立即放成型梳子于腔顶并夹紧,待30-60分钟胶聚合后,取下胶板,放入电泳槽中固定。
(2)加样和电泳
上下槽中加入1×TBE电泳缓冲液,溢过加样孔,拔出梳子,排出加样孔中的气泡,将PCR产物或限制性内切酶消化产物2与1上样缓冲液混匀,用微量注射器加入加样孔底部,使样品在孔底成一层,两侧孔中加入标准分子量的DNA Marker。
以2-10V/cm电压电泳,电泳时间足够长,使片断足以分开,待指示剂走到适宜位置时关闭电源,将胶片取出。
(3)银染
分开两块玻璃板,将凝胶片放入100ml银染固定液中振荡15min,双蒸水洗3次,每次2min,然后将凝胶片转入100ml 0.2%的AgNO3中于摇床上染色约10min,吸去AgNO3液,用双蒸水洗3次,每次30s,加入100ml显色液约7-10min,待DNA带显示清除时,吸去显色液,加入固定液Na2CO3,静置2-3min,取出凝胶观察。