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常见技术问题

PCR反应条件的选择及优化

发布日期:2014-12-27阅读次数:2256
    PCR技术已经在生物学研究和临床医学检验领域中得到了广泛的应用,PCR技术也日臻完善。PCR技术操作简便,特异性强,敏感度极高,正因为敏感度高,很容易受其他因素的影响,因此要得到准确可靠的反应结果,需根据不同的模板,摸索最适合的条件,配制出PCR反应betway必威娱乐城。
    聚合酶链反应必须具备下述基本条件:①模板核酸(DNA或RNA),②人工合成的寡核苷酸引物,③合适的缓冲体系,④镁离子,⑤三磷酸脱氧核苷酸,⑥耐热DNA聚合酶,RNA反转录酶及RNA酶抑制剂(RNasin),⑦温度循环参数(变性、复性和延伸的温度与时间及循环次数)。
1.模板的选择
    PCR反应用DNA(单、双链DNA)或RNA都可以作模板进行核酸的体外扩增。若起始材料是RNA,须先通过逆转录得到cDNA后才能进行正常PCR扩增。核酸标本来源广泛,可以从纯培养的细胞或微生物中直接提取,也可以从临床标本(血、尿、便、痰、体腔积液、漱口水等)、犯罪现场标本(血斑、精斑、毛发等)、病理标本(新鲜或固定石蜡包埋标本)以及木乃伊标本中提取。无论标本来源如何,待扩增核酸都需部分纯化,以使核酸样品中不混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白质。虽然PCR可以仅用微量样品(甚至是来自单一细胞的DNA),但为保证反应的特异性,一般还宜用纳克级(ng)的克隆DNA、微克水平的染色体DNA或102-105拷贝的待扩增DNA片段做起始材料。
2.引物
    PCR扩增产物的大小及扩增的靶序列在基因组中的位置是由引物限定的。因此,引物的选择与合成对PCR成功与否具有决定性意义。对某一DNA片段来说,由于同源顺序的存在,随意设计的两条引物链,其PCR产物经电泳分析时可能会出现多条电泳带。因此,在引物的设计过程中要考虑引物链的特异性,即它们只与被检测的DNA片断互补。
(1)    引物长度以16-30个碱基为宜,最佳20-24个bp,不会形成稳定的复合体。
(2)    有时引物不起作用,理由不明,可以移动序列位置来解决。
(3)    (G+C)%含量一般40%-60%为佳,两个引物中(G+C)%含量应尽量相似。
(4)    两个引物之间不应发生互补,特别是在引物3’端避免形成“引物二聚体”。如无法避免,其3’端互补不应大于2个碱基。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列,避免同源序列(尤其6个以上相同)。
(5)    引物内部避免形成次级结构,尤其是发卡结构,必要时应通过计算机进行结构分析。
(6)    引物浓度不宜偏高,浓度过高有两个弊端,一是易形成引物二聚体,二是当扩增微量靶目标并且起始材料又不太纯时容易产生非特异性产物。一般来说,用低浓度引物不仅经济,反应特异性也较好。
3.镁离子浓度
    Mg2+浓度对PCR扩增反应的特异性和产量有着显著影响。PCR中常用的体系应Mg2+浓度为1.5mmol/L,但对不同的反应体系应优化Mg2+浓度。浓度过高,使反应特异性降低;浓度过低,使产物产量减少。PCR反应中Mg2+的加入量要比dNTP浓度高0.5-2.5mmol/L。最好对每种PCR反应体系Mg2+量的优化。另外,还需注意引物和模板DNA原液中是否含EDTA等螯合剂影响游离Mg2+的浓度。
4.三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)
    PCR反应中每种dNTP的终浓度为50-200μmol/L,在此范围内,扩增产物量、特异性与合成忠实性这间的平衡最佳,dNTP浓度过低必然影响扩增产量,过高则会导致错误掺入,其浓度不能低于10-15μmol/L。由于dNTP的量还受其他因素的影响,所以不同反应体系中dNTP的最佳浓度不尽相同。
5、TapDNA聚合酶
    在其他参数最佳时,每100μl反应液中含1-2.5u Taq DNa酶。然而酶的需要量可以根据不同的模板分子或引物而变化,当优化一种PCR反应体系时,最好在每100μl体积中加入0.5-5u酶的范围内试验最佳酶浓度。如酶浓度太高,会出现非特异性扩增,而过低时,则扩增产量太低。另外不同来源的Taq DNA酶、测定条件和单位定义的不同、生产厂家产品品质的优劣,这些都是使用Taq酶时需要考虑的因素。
6.温度循环参数
    变性温度通常为94℃左右,主要取决于扩增片段的长度和(G+C)的比例,达不到变性温度致使变性不完全,是导致PCR失败的常见原因。变性时间一般为30-60秒,时间太长不但没有必要反而会因降低酶的活性而影响产量和反应特异性。常用PCR一般为20-40个周期,随着周期次数增加TaqDNA聚合酶活性降低,聚合时间延长,引物或单核苷酸减少等原因,会造成反应后期容易发生错误碱基掺入。所以在满足产物得率的前提下,应尽量减少周期次数。
7.石蜡油
    加入石蜡油的目的是防止反应液蒸发,以免造成反应体积和成分的改变,特别是当反应体积小或反应条件严格时更应注意。反应中加入的石蜡油必须是高质量的,无菌的,不能含有抑制PCR反应中各种betway必威娱乐城活性的污染物,加入的体积要求不太严格,应以盖住反应液液面为度。
8.平台效应
    “平台效应”是指PCR后期循环产物累积趋于饱和,使原来以指数增长的速率变成平坦的曲线,同时出现非特异产物的大量增加的现象。下列因素可能与平台效应有关:
(1)dNTP或引物的消耗量。
(2)反应物的稳定度(dNTP或酶)
(3)最终产物的阻化作用(焦磷酸盐、双链DNA)。
(4)非特异产物或引物二聚体与反应物的竞争。
(5)产物在高浓度时变性不完全,影响引物的延伸。
(6)酶与PCR产物的结合,使酶分子减少。
    合理的PCR循环参数,能最大限度地避免这些因素对产物扩增的影响。